Caco-2细胞转运实验
来源/作者:中国优德游戏app官网优德游戏app官网网  日期:2017-03-14

人结肠癌细胞系Caco-2是用来研究药物经肠吸收的常用模型。Caco-2细胞体外培养条件下可自发进行上皮样分化,形成与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接,形态学,标志酶的功能表达及渗透特征都与小肠柱状上皮细胞很相似。在Caco-2细胞中,主要药物转运体如寡肽转运体PEPTI,P-糖蛋白MDRI,多药耐药相关转运蛋白MRP2和有机阴离子转运多肽OATP2B1均有较高水平表达,能够快速得到药物的跨膜转运属性。此外,Caco-2细胞还表达一些肠道常见的糖苷酶氨肽酶,酯酶和代谢酶,可考察存在代谢的情况下药物的转运情况。由Caco-2细胞获得的药物表观渗透系数(Papp)与人小肠吸收具有良好的相关性,作为药物吸收研究的一种快速筛选工具,Caco-2细胞模型已广泛用于体外药物分子小肠吸收的研究。

Caco-2细胞模型是将Caco-2细胞接种于半透膜(多为聚碳酸酯多孔膜)上,待细胞生长分化为完整的细胞单层(一般21~24天),即可模拟人体肠道上皮吸收屏障,用于药物通透性实验(图11-5)。

近来研究发现,犬肾上皮细胞系MDCK Ⅱ和Caco-2细胞在许多药物的转运上具有很好的相关性,且其培养周期较短(3~5天)即可形成完整细胞单层,可以作为一种改良的Caco-2细胞模型,进行药物的经肠吸收研究(图11-6)。

【材料】

1.状态良好的人结肠癌细胞。

2.试剂胰蛋白酶小牛血清,培养基(DMEM培养粉),双抗。乳酸脱氢酶检测试剂盒,酚磺酞或荧光黄,D-Hanks液(每l000ml含NaCl 8.OOg,KC10.40g,NaH2P04·H20 0.06g, NaHC03 0.35g,酚磺酞0.02g) ,Hanks液(在D-Hanks液加MgS04·7H20 0.20g, CaCl2(无水)0. 14g,葡萄糖1.00g) ,75%乙醇

3.仪器净化工作台,C02孵箱,倒置显微镜,细胞计数板,电阻仪,酶标仪,TransweⅡ小室,HPLC/MS/MS(或核素标记检测)。

【方法】

1. Caco-2细胞的培养复苏细胞,加入DMEM培养液(内含10%小牛血清青霉素100ug/ml,链霉素100 ug/ml )吹打数次,制成细胞悬液,计数。按(3~5)x104/ml密度接种于培养瓶或培养板中,置37℃,5% CO2的孵箱中培养,12小时后换液一次,以后每2天换液一次。细胞生长融合80%左右,即可传代培养;显微镜观察Caco-2细胞生长状态良好,形态规则,分化完好,边界清晰,即可进行试验。MDCK II细胞培养方法相同。

2.接种铺板将状态良好的细胞消化,吹打均匀,调节密度104~105/ml,吸取0.4ml细胞悬液接种于TransweⅡ小室,置于24孔板中,外孔加0.6ml培养液,内外孔液面大致等高。

3.培养换液隔天换液。Caco-2细胞接种一周后每天换液。镊子用乙醇棉擦拭消毒,过火冷却后,夹出TransweⅡ小室,倾斜倒出培养液,用移液枪吸出24孔板中培养液后放回TransweⅡ小室,在小室内外轻柔加入适量D-Hanks液,冲洗残留废液;然后加入新鲜培养液,内孔0.4ml外孔0.6ml。

4.检测电阻 检测前一天,电极紫外灭菌过夜。使用前电极用75%乙醇浸泡15分钟,D-hanks液冲洗后37℃ Hanks液孵育30分钟;同时,用37℃ Hanks液轻柔地清洗细胞单层3次以除去表面杂质,然后加入37℃ Hanks液内孔0.4ml外孔0.6m1置于培养箱中孵育30分钟。

然后,连接电极和机身,打开电阻仪电源,选择电阻挡,按下测试键“test”显示1000Ω(若选择电压挡则为1),表示状态良好,可以使用。将电极置于TransweⅡ小室内外侧,没入Hanks液中,内短外长。最后,按下测量键“measure”,读取电阻值。

测量后弃掉Hanks液,更换新鲜培养液继续培养或进行转运实验。电极用D-hanks液冲洗后静置阴干。Caco-2细胞培养21天,TEER值可达到300Ω·cm2。MDCKⅡ细胞培养3~5天,TEER值可达到100~800Ω·cm2

5.检测酚磺酞或荧光黄通透率以酚磺酞为例。用37℃ Hanks液轻柔地清洗细胞单层3次以除去表面杂质,然后加入37℃ Hanks液内孔0.4ml外孔0.6ml置于培荞箱中孵育30分钟。在小室内侧(供药侧)加入酚磺酞(终浓度为5 mg/ml )并计时,设定时间点(0.5小时,1小时,2小时,3小时)在小室外侧(受药侧)取Hanks液0.1 ml待测,然后补加相应体积的空白37℃ Hanks液;酶标仪检测待测液吸光度,波长560nm;配制优德游戏app官网曲线,计算酚磺酞浓度。Caco-2细胞培养21天,TEER值达到300Ω·cm2后,酚磺酞(或荧光黄,甘露醇等)的漏出量应<5% , Papp≤107 cm/s,说明Caco-2细胞单层完整,可用于药物透过研究。MDCK Ⅱ细胞培养3~5天,酚磺酞等标志物的漏出量和Papp即可达到此水平。

6.通透性实验为了模拟肠道环境,转运实验时,Caco-2细胞单层AP侧缓冲液pH为6.0,BL侧缓冲液pH为7.4,以下缓冲液pH均按照此要求配制。MDCK Ⅱ细胞单层无此要求。

首先弃去TransweⅡ小室内外培养液,用37℃ Hanks液轻柔地清洗细胞表面3次以除去表面的杂质,然后加入37℃ Hanks液(内孔0.4ml,外孔0.6ml)置于37℃孵箱中孵育30分钟。

吸去缓冲优德游戏app官网,在AP侧(内孔)加入0.4ml含有受试药物的Hanks液,作为供给液,在BL侧(外孔)加入0.6m1空白的Hanks液作为接收液。此为吸收方向,A-B。

7.外排实验弃去TransweⅡ小室内外培养液,在BL(外孔)侧加入0.6ml含有受试药物的Hanks液,作为供给液,在AP侧(内孔)加入0.4m1空白的Hanks液作为接收液。此为外排方向,B-A。

8.双向转运实验相同药物同时进行通透性实验和外排实验,考察药物的渗透方向率(PDR)。

9.采样和检测将载有TransweⅡ小室的24孔板于恒温摇床(37℃,50r/min)中温孵,设定时间(0.5小时,1小时,2小时,3小时)从接受池取出50ul的接受液待测,然后补加相应体积的空白37℃ Hanks液。

转运实验结束后,夹出TransweⅡ小室,用冰冷D-Hanks液彻底冲洗,置入新的24孔板中,向小室内加入200ul裂解液,恒温摇床(37℃,50r/min)中裂解2小时。裂解液测定药物浓度和蛋白含量。

样品加等体积乙腈沉淀蛋白,涡旋,离心,吸取上清液吹干,流动相复溶,涡旋,离心,吸取上清液进样,质谱检测。蛋白含量用BCA试剂盒测定。

10.实验过程中细胞单层完整性的监测在通透性试验过程中,可以通过监测TEER值,缓冲液中乳酸脱氢酶活性的变化,确保整个过程中细胞单层的完整性;也可以在供给液中加入酚磺酞或荧光黄等标志物,同时测定标志物的通透率作为对照。

[结果与分析]

1. TEER值的计算TEER(Ω·cm2)=[测得电阻值-空白小室(未接触细胞的小室,电阻在100~150Ω)电阻值]x0.6cm2聚碳酸酯多孔膜面积)

Caco-2细胞单层TEER值随培养天数递增,15天后渐趋平缓,21天后可达200~600Ω·cm2。MDCK Ⅱ细胞培养3~5天,TEER值可达到l00Ω·cm2以上。

2.转运图和摄取图通过测定受药侧缓冲液中待测药物的含量以及通透性实验结束后细胞内蓄积的药物含量,可以用转运图和摄取图直观的表示药物的跨细胞转运属性。

转运图的横坐标为时间(min),纵坐标是单位面积的细胞单层转运的药物量(mol/Cm2)。由于药物的跨膜转运过程比较缓慢,所以在较长时间内转运图大致为直线上升趋势(图11-7)。

摄取图的纵坐标是单位重量的转运体表达量(以细胞总蛋白量计算)摄取的药物量(mol/mg protein)。摄取图能反映药物在细胞内的蓄积情况,从侧面反映药物的跨膜转运情况。

3.表观渗透系数(PaPP,cm/s)的计算

其中C0是受试药物供给池药物初始浓度,dQ/dt为接收池药物出现的速率,A为聚碳脂膜的表面积。

如果将转运图中横坐标的单位以秒(s)计算,则dQ/dt即为转运图拟合直线的斜率。再除以A和Co,即PaPP。一般认为,吸收良好的药物,其表观渗透系数为PaPP>1×10-6 cm/s;而吸收较差的药物,其PaPP<1×1O-7 cm/s。

4.渗透方向率(PDR)的计算

通过被动转运的药物,不管是细胞旁路还是跨细胞扩散,其PDR均为1左右;如果药物的PDR显著偏离1,则提示主动转运的存在。例如二肽Gly-Sar,其肠道吸收经由寡肽转运体PEPTI介导,由Caco-2细胞模型得到的PDR (A-B/B-A)为4.8 ;而P-gp的典型底物Rhodamine 123,其PDR(B-A/A-B)可达15左右。通过分析药物跨膜转运的PDR,可得到药物跨膜转运的作用靶点以及机制等信息。

【注意事项】

1.换液TransweⅡ小室内的培养液尽量倒出而不用移液枪,添加培养液时枪头要贴小室侧壁缓慢加液,任何情况下都要避免枪头,镊子及电极等物体与小室底部的多聚碳酸酯膜接触,防止细胞单层和半透膜的破坏。

2.确保的细胞单层完整性Caco-2细胞单层完整是细胞转运模型建立成功的关键,可通过以下方法确保细胞单层的完整性。①铺板前,用电子显微镜或光学倒置显微镜进行形态学检查,确定Caco-2细胞状态良好才能铺板;②铺板后,无法用显微镜观察细胞形态,须用电阻仪定期测量单细胞层的电阻(TEER)值,TEER应随培养天数而递增,两周后逐步稳定,如果TEER值突然下降,则说明细胞单层被破坏,不能继续培养,用于药物转运实验;③在转运实验进行前或进行过程中,应检测标志物被动扩散的跨膜通量,通常用甘露醇,菊糖,荧光黄及酚磺酞等通过被动扩散转运的小分子,其漏出量应小于5%,满足Papp≤107 cm/s;④在转运实验开始和结束时,应检测缓冲液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,如果细胞单层被破坏,会有大量LDH漏出。

3.确保Caco-2细胞的功能分化碱性磷酸酶是小肠刷状缘细胞的标志性酶,在单细胞层培养的不同阶段应测定其活性,考察Caco-2细胞的分化情况。但是这种方法必须破坏细胞单层的生长,局限于方法学验证的实验中。药物通透性实验时,通常进行典型底物的跨膜转运实验,以验证Caco-2细胞的功能分化。例如考察PEPT1的功能,可通过Gly-Sar的转运情况反映;Rhodamine 123的转运情况则反映Caco-2细胞P-gp的表达情况。

4.无菌操作是Caco-2细胞转运模型建立成功的必备条件由于Caco-2细胞须培养21天才能分化形成完整的细胞单层,所以在培养过程中一定要保证无菌操作,避免细胞污染。应用MDCK细胞模型,可将培养周期缩短至3~5天,大大减小了污染的可能性。

【关键词】糖苷酶 肽酶 聚碳酸酯 小牛血清 胰蛋白酶
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